Hopp til innhold

Mikrobiologiske analyser

Publisert

I tillegg til å gi kunnskap om tekniske- og prosessmessige forhold, kan analyser av legionellabakterier være et nyttig grunnlag ved valg av forebyggende tiltak, og for å vurdere effekten av gjennomførte tiltak.

I tillegg til å gi kunnskap om tekniske- og prosessmessige forhold, kan analyser av legionellabakterier være et nyttig grunnlag ved valg av forebyggende tiltak, og for å vurdere effekten av gjennomførte tiltak.


Grunnlag for planlegging

Mikrobiologiske analyser benyttes:

Det er viktig å være klar over at mikrobiologiske analyser alltid vil være et supplement til kunnskap om tekniske og prosessmessige forhold, de vil ikke kunne stå alene som vurderingsgrunnlag.

Ved planlegging av de mikrobiologiske undersøkelsene må man bestemme seg for følgende:

  • Hvordan/til hva skal resultatene brukes
  • I hvilke deler av anlegget skal prøvene tas
  • Hva skal det tas prøver av
  • Hvor ofte skal det tas ut prøver
  • Over hvor lang tidsperiode skal prøvetakingen skje
  • Hva skal prøvene analyseres for
  • Hvilke analysemetoder skal benyttes

Hva sier analysene?

Kunnskapsgrunnlaget for å kunne vurdere smitterisiko basert på legionellaanalyser er begrenset. Kvantitative legionellaanalyser er ikke egnet til å fastslå smitterisiko fordi det er vanskelig å ta representative prøver, og fordi det foreligger begrenset kunnskap om tolkning av analyseverdier i forhold til smitterisiko.

Som beskrevet nedenfor, kan Legionella analyseres ved dyrknings- eller PCR-teknikk. Metodene har begge sine styrker og svakheter. Dyrkning er den metoden man har mest erfaring med, og hvor det internasjonalt er benyttet grenseverdier for tolkning av resultater. Det er imidlertid økende bruk av PCR-teknikk, som er en mer følsom analysemetode. Dokumentasjon som viser sammenheng mellom analyseresultatene for de to metodene, er fortsatt begrenset. Vår anbefaling om bruk av legionellaanalyser må ses i lys av dette.

I vann fra råvannskilder finnes nesten alltid legionellabakterier i lave konsentrasjoner. Det må derfor forventes at de påvises sporadisk i prøver av vann fra vannverket. Ved bruk av PCR-metodikk påvises det nesten alltid et bakgrunnsnivå. Hvis legionellabakterier har etablert seg i en biofilm, vil de kunne påvises i et større antall prøver enn hva bakgrunnsnivåene skulle tilsi.

De påviste konsentrasjoner vil være avhengig av hvor mye biofilm som har løsnet fra veggene før prøvetakningen, og om eventuelle amøber har sprukket opp og frigjort legionellabakterier. Prøver som er tatt like etter at biofilm har løsnet, vil kunne ha et høyt antall legionellabakterier, mens prøver som er tatt til andre tider vil kunne ha et lavt, eller ikke påviselig, innhold. En negativ legionellaprøve er altså ingen garanti for at legionellabakterier ikke er til stede, og kan derfor gi falsk trygghet.  Motsatt vil påvisning av legionellabakterier ikke være et sikkert ”bevis” på at systemet er ute av kontroll, da lave antall legionellabakterier finnes i de fleste vannkilder. Det er derfor vanskelig å si noe om i hvilken grad et anlegg er forurenset med legionellabakterier ut fra enkeltanalyser. 

Ved regelmessige, for eksempel månedlige, analyser vil frekvensen av positive prøver være en viktig parameter. Unormalt høye funn kan tyde på at legionellabakterier har etablert seg selv om de forekommer i et fåtall av prøvene. Slike funn bør følges opp med flere analyser.

Hvis det i gjentatte prøveserier ikke er blitt påvist Legionella spp. i noen av prøvene som er analysert, bør dette normalt være tilstrekkelig dokumentasjon på at anlegget ikke representerer noen fare for spredning av legionellasmitte under de driftsforhold som prøvetakingsperioden er representativ for.

Analyseparametere

I forbindelse med risikovurderinger anbefales det å analysere for legionellabakterier fordi erfaringer har vist at kimtall i mange tilfeller ikke er en egnet indikatorparameter for mulig forekomst av legionellabakterier. Kimtallsanalyser gir et generelt bilde av den mikrobiologiske aktiviteten og utviklingen av biofilmdannelse i systemet, og vil kunne være et supplement ved planlegging av forebyggende tiltak. I driftsoppfølgingen vil både legionella- og kimtallsanalyser være aktuelle avhengig av hva som skal verifiseres, se Kimtallsanalyser nedenfor.

I vurderingen av analyseresultatene bør det legges vekt på forekomst av Legionella spp. fordi det er grunn til å regne med at om det finnes én type legionellabakterie, vil også andre typer kunne gro der. Dette betyr at om det påvises typer som ikke er ansett for å være smittefarlige, kan forekomst av smittefarlige varianter heller ikke utelukkes. Dersom man finner Legionella spp., kan det i tillegg være fornuftig å analysere for Legionella pneumophila serogruppe 1, fordi denne er ansett for å være blant de mest smittefarlige variantene. Om denne påvises, er det derfor mer presserende å gjennomføre tiltak.

Prøvene bør analyseres av et akkreditert laboratorium, eller et laboratorium som på annen måte kan dokumentere sin kvalitetssikring.

Prøveuttak

Prøvestedene bør lokaliseres nærmest mulig områder der den tekniske og prosessmessige gjennomgangen indikerer at vekstbetingelsene for legionellabakterier kan være til stede.

Det bør tas prøver av væske nedstrøms de utsatte områdene og om mulig av biofilm (slimete belegg) på rørvegger/andre flater. Laboratoriet som skal analysere prøvene, vil normalt kunne rettlede om hvordan prøvene skal tas. Der hensikten med analysene er å vurdere endringer over tid, er det viktig at prøvene blir tatt på samme sted og måte ved hvert prøveuttak.

Riktig prøvetaking, transport og oppbevaring av vannprøver er viktig når man skal bestemme den mikrobiologiske kvaliteten på vannet. Prøvetaking av vann som skal undersøkes for innhold av mikroorganismer, må utføres slik at de aktuelle mikroorganismene ikke blir tilført vannet fra utstyr som brukes under prøvetakingen, eller fra hendene til den som tar prøvene. Prøveuttak og -volum, håndtering og forsendelse må utføres i henhold til instruks fra laboratoriet. For uttak av prøver fra belegg (biofilm), såkalte svaberprøver, finnes det egne prøvetakingskits.

Tre standarder gir retningslinjer for prøvetaking for mikrobiologisk analyse, hhv. for vannundersøkelse generelt (1), og for Legionella (2) (3). Det anbefales at laboratoriet som skal utføre analysene, kontaktes før prøver tas. Laboratoriet vil ha nødvendig utstyr, sterile prøveflasker, utstyr for sterilisering av prøveuttakspunkt med mer, og vil kunne rettlede i hvordan prøvene skal tas. Prøvene bør helst tas av personer som har erfaring med denne type undersøkelser.

Hva brukes analyser til?

Analyser for å vurdere om et anlegg omfattes av forskrift om miljørettet helsevern

Forskrift om miljørettet helsevern kapittel 3 a (Lovdata) omfatter innretninger som kan spre legionellainfiserte aerosoler.  For mange anlegg,  vet man at faren for legionellavekst er til stede og at forebyggende tiltak må gjennomføres, se Risikokartlegging og forebyggende tiltak. Dersom man ønsker unntak fra forskriften kreves dokumentasjon på at vekst og spredning av Legionella ikke vil kunne forekomme. Eksempler på slike anlegg er luftskrubbere, hvor prosessbetingelsene er slik at legionellabakteriene ikke vil kunne vokse.

En slik dokumentasjon må omfatte en grundig beskrivelse av at prosess- og konstruksjonsmessige forhold hindrer legionellavekst. I tillegg bør det tas månedlige prøver av Legionella spp. fra representative prøvepunkter i ett år, som alle må være negative for å bekrefte konklusjonene fra den tekniske gjennomgangen.

Analyser i risikovurderinger, som grunnlag for etablering av forebyggende tiltak

Innholdet i en risikovurdering er beskrevet i Risikokartlegging og forebyggende tiltak. Det mest sentrale i en risikovurdering er å vurdere anleggets utforming og prosessrelaterte faktorer for legionellabakterienes vekstbetingelser, slik at tiltak kan rettes mot de mest kritiske faktorene.  De mikrobiologiske analysene er et supplement. Valg av prøvepunkter gjøres på grunnlag av den tekniske gjennomgangen. Prøveomfanget fastsettes på grunnlag av anleggets kompleksitet og risikokategori. For anlegg i risikokategori 3 vil det i de fleste tilfeller være tilstrekkelig med en grundig teknisk gjennomgang. For anlegg som er karakterisert i risikokategori 1, bør prøvefrekvensen være månedlig. For å få et tilstrekkelig beslutningsgrunnlag bør prøvefrekvensen aldri være lavere enn hvert kvartal, Prøveperioden bør vare ett år, men resultatene må vurderes fortløpende for å fastslå behovet for å gjennomføre forebyggende tiltak. Prøvene bør tas i perioder da det kan forventes at vekstforholdene er eller har vært gunstige, for eksempel i perioder da væskens sammensetning eller temperatur er slik at legionellabakterier kan trives.

Analyser som grunnlag for å verifisere effekt av tekniske og driftsmessige tiltak

Hensikten med mikrobiologiske analyser i driftssammenheng er å verifisere at de tekniske tiltakene og de fastsatte driftsrutinene fungerer etter hensikten. Omfanget av analyser og valg av analyseparametere vil variere avhengig av hvilke type anlegg det dreier seg om, hvilke forebyggende rutiner som er etablert, om det benyttes intermittent eller kontinuerlig vannbehandling, kunnskap om effektiviteten av og erfaringer med behandlingsmetoden som benyttes, og hvilken risikokategori anlegget tilhører.

Anbefalinger om mikrobiologisk overvåking er omtalt under de respektive anleggstypene.

Generelt gjelder at det bør tas hyppigere analyser den første tiden etter etablering av nye rutiner. Ved valg av prøvepunkter bør det tas utgangspunkt i risikovurderingen. Etter at forholdene har stabilisert seg ved at tilfredsstillende driftsrutiner er etablert, kan prøvetakingsfrekvensen reduseres. For anlegg i risikokategori 1 bør minimumsfrekvens for analyser av Legionella spp, være kvartalsvis. For anlegg i risikokategori 3 vil driftsanalyser normalt være unødvendig.

For anlegg som rengjøres og desinfiseres periodisk, for eksempel kjøletårn og luftskrubbere, vil analyser av kimtall kunne være et billigere alternativ for å dokumentere desinfeksjonseffektiviteten. Det kan også være hensiktsmessig å analysere for legionellabakterier rett før periodisk behandling for å vurdere om behandlingen og/eller behandlingsfrekvensen har vært tilfredsstillende. Analyse av legionellabakterier ved bruk av PCR-teknikk er ikke egnet i slike tilfeller, fordi metoden ikke skiller mellom levende og døde bakterier.

Analysemetoder for påvisning av legionellabakterier og kimtall

Legionellaanalyser

Analyser av Legionella i vann og slamprøver kan utføres med to prinsipielt ulike metoder, enten ved konvensjonell dyrkning eller ved bruk av polymerase kjedereaksjon (PCR). Da disse analysemetodene er basert på helt ulike prinsipper, er det vanskelig å sammenlikne resultatene direkte.

Uansett metode må nedre bestemmelsesgrense angis ved presentasjon av analyseresultater.

Dyrkning

Dyrkningsanalyser for ”rene” prøver (fra dusj- og sanitæranlegg) utføres i henhold til internasjonal Standard ISO 11731:2017(2). Dette er en membranfiltermetode der legionellabakterier oppkonsentreres ved filtrering, alternativt ved sentrifugering, av minimum 100 ml vannprøve (vanligvis 500 ml eller 1000 ml). Sediment- eller biofilmprøver og vannprøver med høyt bakterieinnhold utføres i henhold til internasjonal Standard ISO 11731 (2). Prøvene dyrkes etter samme metode som for ”rene” prøver men direkte etter fortynning, uten filtrering, eventuelt etter oppkonsentrering ved sentrifugering. Videre biokjemiske og serologiske tester er nødvendig for artsbestemmelse av legionellabakteriene. Resultatet angis vanligvis som koloniformende enheter per liter vann (CFU/L).

Prøvene skal leveres laboratoriet så snart som mulig, helst innen 24 timer, men ikke senere enn 48 timer.

Fordeler med dyrkning:

  • Viser tilstedeværelsen av levende bakterier
  • Eneste metode som kan identifisere spesifikt serogruppe
  • Eneste metode som kan brukes til å sammenlikne legionellabakterier isolert fra pasient(er) og potensielle smittekilder
  • Sammenliknet med PCR har man et bedre referansegrunnlag mht. tolkning av analyseresultat. Alt som er angitt av risikobaserte grenseverdier i internasjonal litteratur, er basert på dyrkningsmetodikk

Svakheter med dyrkning:

  • Analysen tar lang tid
    • Et positivt resultat kan verifiseres i løpet av 5-6 dager, mens et negativt resultat kan ta inntil 12 dager å bekrefte
  • Analyseresultater vil kunne vise et lavere antall legionellabakterier enn det faktiske antallet i en prøve, bla. forårsaket av:
    • Tap av bakterier ved filtrering (opptil 90 % tap ved bruk av filtertyper nevnt i standard)
    • Andre bakterier i prøven som undertrykker legionellavekst
    • At forholdene i prøven (næringstilgang, pH, temperatur m.m.) er ugunstige for legionellabakterier, slik at de forefinnes i en levende, men ikke dyrkbar fase
    • At bakterier som finnes intracellulært i protozoer, ikke påvises, så fremt protozoene ikke lyseres på forhånd
    • At et aggregat av bakterier telles som én bakterie
    • At det finnes legionellaarter som ikke vokser på det dyrkningsmediet som benyttes, og som dermed ikke påvises

Selv om metoden vil kunne gi et for lavt anslag over antall bakterier, og at det dermed kan finnes legionellabakterier i en prøve selv om analysen ikke påviser disse, er det ut fra erfaring likevel grunn til å regne med at smittefaren fra et anlegg hvorfra man i dyrkningsprøver ikke finner legioneller, normalt er lav.

PCR (Polymerase kjedereaksjon)

PCR er en metode som ved hjelp av genteknologiske teknikker påviser karakteristiske deler av en bakteries arveanlegg (DNA/RNA) i en prøve. Resultatet av en kvantitativ PCR-analyse angis som genomiske enheter per liter (GU/l). Analysemetoden er beskrevet i standarden ISO/TS 12869 (3).

PCR-metode brukes til å kopiere og mangfoldiggjøre spesifikke deler av en mikroorganismes arveanlegg (DNA- eller RNA-sekvenser) for å kunne påvise forekomst av en spesiell mikrobe i en vann- eller slamprøve (biofilm).  PCR-reaksjonen har fått sitt navn fra den engelske betegnelsen ”Polymerase Chain Reaction”. Kort sagt lages millioner kopier av deler av en organismes arveanlegg (DNA eller RNA) dersom den aktuelle organismen finnes i prøven. Metoden gjennomføres i sykluser, hvor man for hver syklus fordobler antallet av den delen av genomet man kopierer. Etter 30 sykluser vil man kunne få laget mer enn en milliard kopier.

De delene av arvestoffet som brukes i testen er karakteristiske for hver organisme man ønsker å påvise, og de trenger i utgangspunktet kun finnes i et svært lavt antall i vannprøven.  Metoden er derfor mer følsom enn dyrkning. Når man måler på DNA kan man imidlertid ikke vite om bakteriene i prøven har vært døde eller levende på prøvetakingstidspunktet, men påvises legionellabakterier er det en indikasjon på at vekstbetingelsene er til stede. Påvises Legionella pneumophila ved hjelp av PCR-teknikk betyr det at genmateriale fra denne arten er til stede.

Ved hjelp av såkalt real time PCR er det mulig å kvantifisere den opprinnelige mengden av genmateriale fra for eksempel Legionella pneumophila i prøven.

Erfaring viser at det nesten alltid påvises et bakgrunnsnivå av Legionella spp. ved bruk av PCR-teknikk. Som grunnlag for å vurdere legionellaforekomsten i et anlegg, bør det derfor tas prøve av tilførselsvannet til anlegget som grunnlag for å vurdere dette bakgrunnsnivået.

Fordeler med PCR:

  • Den kan påvise lave konsentrasjoner av mikrober i en prøve
  • Den gir raskere svar enn dyrkningsmetoden (8-24 t)
  • Påviser også levende, ikke dyrkbare bakterier

Svakheter med PCR:

  • PCR basert på mangfoldiggjøring av DNA-sekvenser påviser genomiske enheter fra både levende og døde bakterier. Dette må det tas hensyn til ved tolkning av resultatene fra prøver tatt ut etter desinfeksjon
  • PCR kan i dag ikke gi fullstendig informasjon om hvilken serogruppe legionellabakteriene tilhører, og kan derfor ikke alene benyttes til smitteoppsporing
  • Prøver fra enkelte installasjoner, for eksempel kjøletårn, luftskrubbere, og skjærevæsker, kan inneholde stoffer som inhiberer PCR-reaksjonen
  • Det er manglende erfaring med å tolke analyseresultater ved bruk av PCR-teknikk. Det er ikke alltid entydig sammenheng mellom resultater av analyser utført etter hhv. PCR- og dyrkningsmetode
  • Det finnes forskjellige metoder på markedet med ulik kvalitet, og det finnes ingen ISO-standard for PCR-analyser

Som ved dyrkning, vil det være tap av bakterier ved filtrering, og bakterier som finnes intracellulært i amøber påvises ikke så fremt amøbene ikke lyseres på forhånd.

«Forenklet legionellaanalyse»

Dersom man ønsker å supplere legionellaanalysene etter ISO 11731 med hyppigere prøver for en tettere oppfølging av forekomsten av legionellabakterier i sitt vannsystem, finnes det på markedet forenklede metoder som kan benyttes uten tilgang til et avansert laboratorium. Metoden er ikke like nøyaktig som ISO-metoden, og de gir kun positivt resultat for L. pneumophila serogruppe 1. De kvantifiserte dataene fra slike analyser kan imidlertid ikke sammenlignes med data fra legionellaanalyser utført i henhold til ISO 11731-standarden.

Kimtallsanalyser

Kimtallsbestemmelser som brukes i forbindelse med legionellakontroll, skal utføres ved dyrkning ved 36 °C i henhold til NS-EN ISO 6222. Metoden påviser de bakteriene som er i stand til å vokse ved 36 °C på det næringsmediet som benyttes.

Høye kimtall kan benyttes som indikasjon på at det er etablert eller under utvikling en biofilm i ledningsnett eller andre overflater i anlegget, men sier ingenting om tilstedeværelse av legionellabakterier i vannet. Biofilmen kan imidlertid gi grunnlag for vekst av amøber og andre protozoer, som igjen kan inneholde legionellabakterier. Kimtall kan derfor benyttes som indikator på hvorvidt det er behov for en rengjøring/desinfeksjon. Kimtallsanalyser bør i så fall tas forholdsvis hyppig og på flere steder i anlegget for å bli kjent med anleggets normale bakgrunnsverdi. Uventede høye funn i hele eller deler av anlegget, kan tilsi at anlegget bør rengjøres eller desinfiseres, eller at det forekommer lokal vekst i blindsoner av anlegget, hvor det da kan gjennomføres tekniske tiltak.

Fordeler med kimtallsanalyser:

  • Kimtallsundersøkelser er billige, raske og teknisk enkle å utføre
  • Høye kimtall indikerer høy bakteriologisk aktivitet og dermed også muligheter for at legioneller vil etablere seg
  • Ved jevnlig prøvetaking kan man følge utviklingen av det generelle bakterienivået og indirekte få en indikasjon på om det foregår en biofilmutvikling i anlegget, eller om de benyttede rengjørings- og desinfeksjonsprosedyrer er effektive for å holde veksten under kontroll

Svakheter med kimtallsanalyser:

  • Det er ingen direkte sammenheng mellom høye kimtall og forekomst av legionellabakterier

”Forenklet kimtallsanalyse”

Dip-slide er en enklere metode som kan utføres av driftspersonell. Det eneste som trengs av spesialutstyr er et termostatstyrt varmeskap. Metoden er ikke like nøyaktig som kimtallsbestemmelse etter NS-EN ISO 6222, men den kan være egnet som ”driftsparameter” på ”urene” systemer (for eksempel kjøletårn og luftskrubberanlegg) for å følge anleggets bakterienivå, og som basis for å kunne gjøre justeringer av eventuell biociddosering i kjøletårn. Dip-slide kan brukes i periodene mellom andre rutinemessige analyser. De kvantifiserte dataene fra Dip-slide kan ikke sammenlignes med data fra kimtallsprøver ihht. ISO-standarden.

 

Referanser

Om artikkelen / endringshistorikk