Molekylær diagnostikk av SARS-Cov-2
Sist endret
Beskrivelse av laboratoriemetoden som benyttes for å påvise arvestoff fra koronavirus - RT-PCR.
For diagnostikk av aktuell covid-19 sykdom brukes laboratoriemetoder der man leter etter selve viruset i prøve fra luftveiene. Dette er meget følsomme tester som baserer seg på oppformering av virusets arvestoff med nukleinsyreamplifiseringstester (NAT). Den mest anvendte metoden for nukleinsyreamplifisering for påvisning av SARS-CoV-2 er real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) og i veilederen fokuseres det derfor på denne metoden.
Nukleinsyreamplifikasjonstester og bruksområder
Nukleinsyreamplifikasjonstest er den anbefalte diagnostiske testen for personer med symptomer på covid-19 etter gjeldende testkriterier. De mest brukte nukleinsyreamplifikasjonstestene i Norge er først og fremst real-time RT-PCR, dernest TMA (transcription-mediated amplification) og LAMP (Loop-mediated isothermal amplification).
De RT-PCR-metodene som brukes ved mikrobiologiske laboratorier i Norge er godt validerte ved de respektive laboratoriene. PCR-basert teknologi har svært høy sensitivitet, og kan påvise tilstedeværelse av virusets genetiske materiale ned til bare noen få genomkopier i en prøve. PCR er en teknologi som benytter seg av sykliske endringer i temperatur, samt tilsetning av primer, prober, enzymer og nukleotider for å oppformere en ønsket gensekvens. Amplifiseringen av gensekvensen detekteres ofte ved hjelp av eksitering av fluorescensmolekyler som aktiveres ved syntese av den aktuelle sekvensen. Metoden skiller ikke mellom intakt virus og rester av virus og sier dermed ikke noe om virusets evne til å gi sykdom eller smitte andre. Betydningen av funnene må derfor alltid tolkes i en klinisk sammenheng.
Hos personer infisert med SARS-CoV-2 vil man vanligvis kunne påvise virusets arvestoff i prøve fra øvre luftveier (tatt fra nese/hals/spytt) i perioden fra ca 2 dager før til 20 dager etter symptomstart. Perioden personen er smittsom ser ut til å være 6-7 dager (i gjennomsnitt fra 2 dager før til 5 dager etter symptomstart). 5 dager etter smittetidspunktet vil ca 50% av de smittede ha utviklet symptomer.
PCR er en spesifikk metode, og eventuelle virusvarianter med endret målgen for PCR-metoden vil kunne være vanskeligere å påvise eller gi falskt negativt analyseresultat. For virusvarianter med endringer i andre deler av genomet, vil påvisningen ikke påvirkes. Den generelle PCR-metoden kan heller ikke påvise alle spesifikke mutasjoner i virusets arvemateriale. For informasjon om påvisning og overvåkning av virusvarianter se: Påvisning av virusvarianter.
Nukleinsyrebaserte hurtigtester
PCR-baserte instrumenter med kort analysetid er i dag stasjonert på enkelte legevakter, akuttmottak eller i laboratoriemiljøer der det er behov for hurtig diagnostisk avklaring med tanke på SARS-CoV-2 og andre luftveisagens. Det produseres egne CE-IVD merkede SARS-CoV-2-kits for bruk i disse maskinene, som påviser SARS-CoV-2 med stor nøyaktighet og høy spesifisitet.
Maskinene krever lite forkunnskap og er enkle å håndtere og kan ofte kobles opp mot eksisterende laboratoriedatasystemer. Instrumentenes analysekapasitet har begrensninger med hensyn til antall prøver som kan analyseres samtidig, men har til gjengjeld rask svartid og større kapasitet til å analysere prøver mer eller mindre fortløpende. De fleste CE-IVD merkede SARS-CoV-2-kitt analysert på slike PCR-baserte plattformer har vist seg å ha tilsvarende sensitivitet og spesifisitet som real-time PCR-teknikk (laboratoriebaserte analyser). Det er særdeles stor etterspørsel etter disse analyseinstrumentene og reagenser, noe som resulterer i ustabile leveranser og risiko for mangelsituasjoner.
Andre nukleinsyrebaserte hurtigtester baserer seg på isoterm oppformering av nukleinsyrer (for eksempel LAMP-teknologi) med spesifikke primere for SARS-CoV-2-viruset. Dette er også meget enkle maskiner i bruk som kan være godt utstyr for pasientnær analysering (PNA). Disse er gjerne et alternativ til antigenhurtigtester med tilsvarende kort analysetid.
For informasjon om andre type hurtigtester:
Sensitivitet, spesifisitet og prediktiv verdi
Testens egenskaper (sensitivitet og spesifisitet) og prediktive verdi har betydning for testing ved ulik prevalens av covid-19 i befolkningen
Sensitivitet og spesifisitet er to sentrale egenskaper ved en diagnostisk test og må vurderes ved bruk av testen.
- Sensitiviteten er sannsynligheten for at en syk pasient får riktig svar, dvs. positiv test.
- Spesifisiteten er sannsynligheten for at en frisk pasient får riktig svar, dvs. negativ test.
Testens evne til å påvise virusets arvestoffer i en prøve kalles analytisk sensitivitet.
Testens evne til å påvise virusets arvestoffer i en prøve kalles analytisk sensitivitet.
Klinisk sensitivitet er testens evne til å påvise viruset hos en reelt smittet person. Den kliniske sensitiviteten vil være avhengig av andre forhold enn kun testens egenskaper, blant annet når i sykdomsforløpet prøven er tatt, tilstedeværelse av virus i det aktuelle prøvematerialet, korrekt prøvetakingsteknikk, samt transport og lagring av prøven.
Vi regner med at den kliniske sensitiviteten ved de metodene som brukes ved de norske mikrobiologiske laboratoriene, er cirka 80 prosent i prøvemateriale fra øvre luftveier (nasofarynks, /halsprøver).
Spesifisiteten til testen (testens evne til å identifisere ikke-smittede individer som negative) er svært høy, opp mot 99,999 prosent.
Som ved all diagnostikk kan testresultater være falsk positive eller falsk negative. De prediktive verdiene beskriver sannsynligheten for at et testresultat gjenspeiler pasientens sanne tilstand:
- Positiv prediktiv verdi (PPV) er sannsynligheten for at en person faktisk har den aktuelle sykdommen gitt at testresultatet er positivt; med andre ord: blant alle som tester positivt, er PPV andelen som virkelig er syke.
- Negativ prediktiv verdi (NPV) er sannsynligheten for at en person faktisk ikke har den aktuelle sykdommen gitt at testresultatet er negativt; med andre ord: blant alle som tester negativt, er NPV andelen som virkelig er friske.
Begge størrelsene er betingede sannsynligheter og avhenger av testens sensitivitet og spesifisitet samt sykdommens forekomst (prevalens/pretest-sannsynlighet) i den testede gruppen. De kan beregnes ved hjelp av denne formelen basert på Bayes’ teorem:
PPV og NPV er sentrale når testens bruksområde skal fastsettes. Sannsynligheten for at et testsvar er riktig avhenger av pretest sannsynligheten: Ved diagnostikk hos pasienter med symptomer som passer med tilstanden (høy pretest-sannsynlighet) blir PPV typisk høyere og NPV lavere enn ved screening av asymptomatiske personer (lav pretest sannsynlighet). Dermed vil samme test gi ulik grad av sikkerhet for «sant positivt» og «sant negativt» avhengig av om den brukes i klinisk diagnostikk eller i screening.